การตรวจหาเชื้อไวรัสเอชพีวีและเอ็มบีวีด้วยกล้องฯ
ข้อมูลโดย .........น.สพ.วิศณุ บุญญาวิวัฒน

วิธีใหม่ในการตรวจโรคไวรัส HPV (Hepatopancreatic Parvovirus) ในลูกกุ้งกุลาดำ

อาจารย์ น.สพ. วิศณุ บุญญาวิวัฒน์
น.สพ. ทินวรรธน์ ศรีสุข
คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

ไวรัส HPV เป็นไวรัสที่พบในประเทศไทยมาตั้งแต่ปี พ.ศ. 2525 แต่เนื่องจากไวรัสชนิดนี้ไม่ทำอันตรายรุนแรงต่อตัวกุ้ง และไม่มีอาการจำเพาะ นอกจากนั้นการประเมินอัตราการตายจากไวรัสเอชพีวียังทำได้ยากเนื่องจากในกรณีที่มีอัตราการตายสูงมักพบว่ามีการติดเชื้อแบคทีเรียเแทรกซ้อน ร่วมทั้งไม่มีข้อมูลบ่งบอกว่าไวรัสทำอันตรายอย่างไรต่อกุ้งบ้าง อย่างไรก็ตามไวรัสตัวนี้เคยถูกสงสัยว่าเป็นสาเหตุทำให้เกิดการตายของกุ้งในช่วงแรกของการนำลงเลี้ยงในบ่อดิน แต่ข้อมูลในปัจจุบันพบว่าไวรัสชนิดนี้เป็นสาเหตุที่ทำให้เกิดลักษณะกุ้งแคระ ซึ่งกุ้งที่ติดไวรัสจำนวนมากจะพบว่ามีน้ำหนักไม่เกิน 5 กรัมหลังจากการเลี้ยงไปแล้ว 4 เดือน ซึ่งกุ้งจำพวกนี้จะไม่ติดอวนในขณะที่เราทำการจับ โดยส่วนมากกุ้งจะหลุดไปสู่แหล่งน้ำธรรมชาติ ทำให้การประเมินอัตราการรอด และผลผลิตต่ำกว่าความเป็นจริง ส่งผลให้ไวรัสชนิดนี้ไม่ค่อยได้รับความสนใจมากนักเมื่อเทียบกับไวรัสของกุ้งกุลาดำชนิดอื่นๆ พึ่งจะมีการตื่นตัวให้ความสำคัญเมื่อเร็วๆนี้เอง ภายหลังจากการพิสูจน์ได้ว่าไวรัสชนิดนี้เป็นสาเหตุทำให้กุ้งไม่โต แคระแกรน เป็นกุ้งจิ้กโก๋ และยิ่งมีการติดเชื้อรุนแรงก็ยิ่งทำให้กุ้งมีขนาดเล็กลงมากขึ้น อย่างไรก็ตามในปัจจุบันยังขาดข้อมูลที่แท้จริงว่าโรคนี้ก่อให้เกิดความเสียหายแก่ธุรกิจการเลี้ยงกุ้งเป็นมูลค่าเท่าใด โดยมีการประมาณการณ์ความสูญเสียภายในบ่อเลี้ยงหนึ่งๆว่า ถ้ามีกุ้งติดไวรัสชนิดนี้จำนวน 10% ของกุ้งทั้งบ่อก็จะมีกุ้งแคระอยู่ภายในบ่อจำนวน 10% กุ้งจำนวนนี้จะแทบจะไม่มีมูลค่าใดๆ และบางส่วนหลุดไปในแหล่งน้ำธรรมชาติในเวลาจับกุ้ง และถ้ากุ้งบ่อนั้นเมื่อจับแล้วมีมูลค่า 500,000 บาท แสดงว่าเกษตรกรสูญเสียรายได้จากกุ้งบ่อนั้นเป็นจำนวนเงินถึง 50,000 บาท ซึ่งนอกจากจะเป็นการสูญเสียรายได้แล้วยังเป็นการทำให้ต้นทุนในการผลิตเพิ่มขึ้นอีกด้วย
ได้มีการศึกษาเปรียบเทียบความรุนแรงของไวรัส HPV กับไวรัส MBV (ที่เราให้ความสำคัญกันมาเป็นเวลานานว่าเป็นตัวการทำให้กุ้งไม่โต แตกไซท์) ในแง่ทำให้กุ้งกุลาดำเกิดการแคระแกรน โดยการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างความยาวของลำตัว กับการติดเชื้อไวรัสทั้ง HPV และ MBV พบว่าการติดเชื้อ MBV (แถวที่ 2) ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับกลุ่มควบคุม (แถวที่ 1) แต่กลุ่มที่ติดเชื้อไวรัส HPV อย่างเดียว (แถวที่ 4) กับกลุ่มที่ติดเชื้อไวรัสทั้ง 2 ชนิด (แถวที่ 3) พบว่าความยาวของลำตัวจะมีขนาดเล็กกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ ดังกราฟที่ 1


จาก Flegal,1999:
กราฟที่ 1 แสดงความยาวของลำตัวกุ้ง แถวที่ 1 กุ้งปกติ, แถวที่ 2 กุ้งติดเชื้อ MBV, แถวที่ 3 กุ้งติดเชื้อทั้ง HPV และ MBV, แถวที่ 4 กุ้งติดเชื้อ HPV
จากข้อมูลเมื่อเปรียบเทียบความรุนแรงในการทำให้เกิดความแคระแกรนของกุ้งกุลาดำระหว่างไวรัส MBV และไวรัส HPV แล้วนั้นจะพบว่า ไวรัส HPV ส่งผลรุนแรงต่อการเจริญเติบโตของกุ้งมากกว่า ไวรัส MBV แต่อย่างไรก็ตามความรุนแรงของไวรัส MBV นั้นยังมีปัจจัยของสภาพการเลี้ยงเป็นปัจจัยเสริมเช่น การเลี้ยงกุ้งที่มีความหนาแน่นสูง สภาพน้ำ และการจัดการที่ไม่ดี เป็นต้น สาเหตุเหล่านี้จะทำให้ไวรัส MBV ก่อความรุนแรงมากขึ้นได้

นอกจากนั้นจากการศึกษาเพื่อหาแหล่งกักโรคของไวรัสชนิดนี้พบว่าไม่สามารถตรวจพบไวรัสได้ในกุ้งระยะตัวอ่อน (นอร์เพลียส) ที่อยู่ในโรงเพาะฟัก แต่สามารถตรวจพบไวรัสครั้งแรกในลูกกุ้งที่อยู่ในระยะกุ้งพี ก่อนที่จะถูกนำไปเลี้ยงในบ่อดิน ทำให้ปัจจุบันนี้ยังไม่สามารถทราบได้ว่าแหล่งกักโรคที่สำคัญของไวรัสชนิดนี้ว่าคืออะไร ลูกกุ้งอาจติดไวรัสจากพ่อแม่กุ้งได้แต่ยังไม่ทราบว่าติดต่อผ่านทางไหน และพบว่าการติดต่อของไวรัส HPV สามารถติดต่อผ่านจากกุ้งตัวหนึ่งสู่กุ้งอีกตัวหนึ่งได้เฉพาะในระยะตัวอ่อน และระยะพีต้นๆเท่านั้น โดยจะไม่มีการติดต่อของไวรัสในกุ้งโตที่เลี้ยงในบ่อดินที่เลี้ยงในบ่อดินบ่อดิน ดังนั้นวิธีการป้องกันความเสียหายจากโรคไวรัส HPV ที่ดีที่สุดก็คือการตรวจสอบลูกกุ้งให้ปลอดโรค หรือมีเชื้อดังกล่าวให้น้อยที่สุดเท่าที่ทำได้ก่อนที่จะนำไปเลี้ยงต่อในบ่อดิน ซึ่งเป็นสิ่งที่เกษตรกรต้องให้ความสำคัญเพิ่มขึ้นนอกจากการตรวจลูกกุ้งให้ปราศจากเชื้อไวรัสดวงขาว และไวรัส MBV แล้ว
ที่ผ่านมาการตรวจหาไวรัส HPV สามารถเลือกใช้ได้หลายวิธีโดยมีข้อดีข้อเสียดังนี้

วิธีการตรวจ ข้อดี ข้อเสีย ความเหมาะสมในการใช้
1.ย้อมสดด้วยสีจิมซ่า หรือสี dip quick (impression smear and Giemsa or dip quick strain)
ข้อดีคือสะดวกรวดเร็ว, ใช้เครื่องมือน้อย
ข้อเสียคือต้องใช้สีที่ห้องแลปบางที่ไม่มีใช้, ถ้ามีการติดไวรัสจำนวนน้อยจะตรวจไม่พบ

2. วิธีทางจุลพยาธิวิทยา (Histopathology)
ข้อดี คือ ให้ความแม่นยำสูงในการตรวจ
ข้อเสียคือ ถ้ามีการติดไวรัสจำนวนน้อยจะตรวจไม่พบ, ใช้เวลามาก, ใช้เครื่องมือมากชิ้น, ค่าใช้จ่ายสูง

3. การตรวจด้วยพีซีอาร์(PCR)
ข้อดีคือ ตรวจพบได้แม้มีไวรัสจำนวนน้อย, มีความแม่นยำในการตรวจ
ข้อเสียคือ ใช้เครื่องมือมากชิ้น, ค่าใช้จ่ายสูง, ผู้ตรวจต้องมีความชำนาญสูง

แม้ว่าในพื้นที่การเลี้ยงกุ้งจะมีเครื่องพีซีอาร์ของเอกชนและราชการ ซึ่งใช้ตรวจโรคดวงขาวกระจายอยู่ทั่วไป แต่ก็ยังไม่มีความพร้อมพอที่จะตรวจโรคไวรัส HPV ด้วยวิธีพีซีอาร์ได้ ดังนั้นวิธีการตรวจหาไวรัส HPV โดยการย้อมสดด้วยสีจิมซ่าจึงเป็นทางเลือกที่เหมาะสมที่จะใช้ในพื้นที่ แต่วิธีดังกล่าวก็จำเป็นต้องใช้สีพิเศษ ซึ่งแลปในพื้นที่การเลี้ยงกุ้งบางแห่งอาจไม่มีสีดังกล่าว ดังนั้นทีมทำงานทางด้านสัตว์น้ำ ของคณะสัตวแพทย์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์อันประกอบไปด้วย อ.น.สพ. วิศณุ บุญญาวิวัฒน์ และ น.สพ. ทินวรรธน์ ศรีสุข จึงได้พยายามดัดแปลง โดยใช้สี 0.1 % มาลาไคท์กรีน ซึ่งเป็นสีที่มีใช้กันอยู่ทุกแลปที่มีการตรวจลูกกุ้งอยู่แล้ว ย้อมสีของตับและตับอ่อนของกุ้งเพื่อตรวจหาอินคูชั่นของไวรัส HPV โดยอาศัยหลักการที่ว่าไวรัส HPV ก็เป็นไวรัสชนิดที่เป็นดีเอ็นเอไวรัสเหมือนไวรัส MBV ดังนั้นก็ควรจะย้อมติดสีมาลาไคท์กรีนได้เหมือนกัน โดยที่ไวรัส HPV จะมีตำแหน่งอยู่ที่ปลายท่อของตับ (apical tubule) ในขณะที่ไวรัส MBV เราจะพบได้ในท่อของตับส่วนต้นหรือส่วนกลาง (proximal or middle tubule) ดังภาพที่ 1และมีวิธีการตรวจใกล้เคียงกับวิธีการตรวจไวรัส MBV ในตับและตับอ่อน ดังที่เคยปฏิบัติกันมา แต่หัวใจสำคัญในการตรวจนี้ก็คือต้องให้ตับและตับอ่อนคงสภาพเป็นพู เป็นท่ออยู่ ถ้าตับและตับอ่อนถูกกด หรือบดจนละเอียดจะทำให้ตรวจหาไวรัส HPV ได้ยากหรืออาจสับสนกับไวรัส MBV ที่มีในตัวอย่าง ข้อดีของวิธีดังกล่าวอีกอย่างหนึ่งก็คือสามารถตรวจไวรัส HPV และ MBV ในตัวอย่างเดียวกันได้พร้อมๆกัน การตรวจดังกล่าวมีขั้นตอนโดยละเอียดดังนี้
1. สุ่มลูกกุ้งกุลาดำขนาดอายุ พี 10-15 จำนวน 10 ตัววางลงบนกระจกสไลด์
2. ใช้ใบมีดโกน หรือมีดผ่าตัดทำการตัดส่วนตา หนวด กรี ทิ้ง และให้ตัดส่วนหัวบริเวณรอยต่อของหัวและลำตัว (end of carapace) เก็บส่วนหัวเอาไว้ ทิ้งส่วนลำตัวไป
3. หยด 0.1% มาลาไคท์กรีนลงบนตัวอย่าง ใช้แผ่นกระจกปิดสไลด์กดลงบนตัวอย่างแรงพอประมาณ ตับและตับอ่อนจะถูกแรงบีบทำให้เคลื่อนตัวออกมานอกเปลือก ทิ้งสไลด์ไว้ประมาณ 5 นาที
4. ส่องตรวจบนกล้องจุลทรรศน์ โดยปฏิบัติเป็นขั้นตอนดังนี้
- ส่องดูตำแหน่งของตับด้วยกำลังขยาย 100 เท่า
- เมื่อพบตับแล้วให้ส่องตรวจบริเวณปลายท่อของตับแต่ละท่อด้วยกำลังขยาย 400 เท่า เมื่อส่องพบลักษณะนิวเคลียสที่ติดสีเขียวเป็นเนื้อเดียว (ลักษณะของอินคูชั่น)
- ต้องทำการตรวจยืนยันให้แน่ชัดอีกโดยการใช้กำลัง 1000 เท่า จะเห็นลักษณะอินคูชั่น ของไวรัส HPV มีลักษณะจำเพาะคือ อินคูชั่นจะมีขนาดใหญ่เกือบเต็มนิวเคลียส และเบียดนิวเคลียร์โครมาตินของกุ้งไปอยู่ด้านข้างดังรูปที่ 2

วิธีดังกล่าวสามารถตรวจหาไวรัส MBV ไปได้พร้อมๆกันโดยส่องตรวจบริเวณตอนกลางของท่อดังที่กล่าวมาและจะพบลักษณะของ ไวรัส MBV ดังรูปที่ 3 ข้อสำคัญในการตรวจคือเมื่อพบลักษณะนิวเคลียสที่เหมือนจะมีอินคูชั่นของไวรัส HPV แล้ว ต้องยืนยันด้วยการดูด้วยกำลังขยาย 1000 เท่า ก่อนที่จะสรุปว่าเป็นไวรัส HPV เพราะถ้าไม่ทำการส่องยืนยันจะมีข้อผิดผลาดได้ง่าย
จะพบว่าวิธีดังกล่าวมีขั้นตอนง่ายๆไม่ยุ่งยาก ผู้ที่ได้รับการฝึกฝนเพียงเวลาไม่นานก็สามารถทำการตรวจได้ แต่การดูลักษณะอินคูชั่นอาจไม่ใช้เรื่องง่ายสำหรับผู้ที่ไม่เคยเห็น และการตรวจดังกล่าวมีผลกระทบโดยตรงต่อการเลือกซื้อลูกกุ้งของเกษตรกร ดังนั้นผู้นำวิธีไปปฏิบัติคงต้องใช้ความระมัดระวังในการตรวจ ร่วมทั้งจะต้องไม่ลืม หรือละเลยในข้อควรระวังที่กล่าวมาแล้ว หรือถ้าต้องการทราบรายละเอียดเพิ่มเติมก็อาจจะติดต่อได้ ที่คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกำแพงแสน จังหวัดนครปฐม ด้วยตนเองหรือโทรศัพท์ (034) 351901-3 ต่อ 201-3 โดยจะปรึกษา อ.น.สพ. วิศณุ บุญญาวิวัฒน์ หรือ น.สพ. ทินวรรธน์ ศรีสุข ในเวลาราชการก็ได้

เอกสารอ้างอิง:
- Flegal, T.W. (2000). Shrimp Viral Diseases I. In: Manual of Diagnosis of shrimp diseases.
- Flegel, T.W. (1999). An overview of prawn viral disease work in Thailand: PCR for shrimp disease diagnosis. Manual of Molecular Diagnostics for Shrimp Viruses in the Asian Region. ACIAR-NSTDA(BIOTEC)-Crawford Fund.
- Lightner,D.V. (1996). HANDBOOK OF SHRIMP PATHOLOGY AND DIAGNOSTIC PROCEDURES FOR DISEASES OF CULTURED PENAEID SHRIMP. The world Aquaculture society.